熒光標(biāo)記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，當(dāng)受到某一波段光照射時(shí)激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)基態(tài)時(shí)可發(fā)出熒光。熒光標(biāo)記技術(shù)是將熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，利用它的熒光特性來提供被研究對(duì)象的信息。熒光標(biāo)記具有的無放射物污染、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，使其在許多研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛，如免疫病理、細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞學(xué)。
索萊寶SAlexa Fluor熒光素抗體標(biāo)記試劑盒中的SAlexa Fluor熒光素連接有N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯，NHS酯可以和伯胺反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)酰胺鍵并釋放出NHS基團(tuán)。一般一個(gè)IgG分子結(jié)合2~8個(gè)SAlexa Fluor熒光素分子可達(dá)到良好的熒光標(biāo)記效果。
產(chǎn)品信息
試劑盒組分
組分 | 數(shù)量 |
SAlexa Fluor熒光素 | 1 |
pH調(diào)整緩沖液(0.1mL) | 1 |
1*PBS(1mL) | 2 |
DMSO(0.1mL) | 1 |
純化柱 | 2 |
收集管 | 2 |
試劑盒規(guī)格
一個(gè)試劑盒可標(biāo)記100μg~2mg抗體
使用說明
01
抗體準(zhǔn)備
1
建議抗體濃度調(diào)整到1~2mg/mL。
2
使用本試劑盒標(biāo)記的抗體溶液，pH在6.5~8.5為宜，最好為PBS緩沖液。緩沖液中不應(yīng)當(dāng)含有BSA等蛋白，也不應(yīng)當(dāng)含有甘氨酸或Tris等含有游離氨基的鹽類，否則可能會(huì)影響標(biāo)記效果。
02
抗體標(biāo)記
1
取出SAlexa Fluor染料離心數(shù)秒，將管中干粉甩至管底。注：未離心前請(qǐng)勿開蓋，以免造成損失。
2
SAlexa Fluor管中加入40mL DMSO用漩渦混勻儀混勻10~20s，至SAlexa Fluor全部溶解，瞬離5~10s，使溶解后的SAlexa Fluor溶液離心至管底。
3
抗體中加入1/10體積的調(diào)整緩沖液。
4
將溶解后的SAlexa Fluor加入抗體中(每0.1mg抗體中加入2mLSAlexa Fluor)，用移液槍反復(fù)吹打混勻或用漩渦混勻儀混勻10~20s。
5
將抗體與SAlexa Fluor混合物置水平搖床或旋轉(zhuǎn)混勻儀，在搖動(dòng)狀態(tài)下室溫避光反應(yīng)1~2小時(shí)。
03
游離SAlexa Fluor染料的去除
1
將純化柱下方堵頭掰斷，1000×g離心1 min倒掉保護(hù)液，將純化柱移至新的收集管中。
2
將0.2 mL PBS加入管中，待全部滲入填料后，1000×g離心1min，重復(fù)2次。
3
將標(biāo)記反應(yīng)液加入到純化柱填料表面。如果樣品體積小于50mL，用試劑盒中的PBS補(bǔ)齊至50mL。上樣體積最大不要超過200mL。
4
待樣品滲入填料后，1000×g離心2min，收集純化的蛋白溶液。
5
將抗體標(biāo)記物4℃避光保存待用。
04
標(biāo)記抗體保存
標(biāo)記抗體可4℃避光保存，也可以根據(jù)需要選擇加入BSA、防腐劑、甘油等成分保證產(chǎn)品穩(wěn)定。
*推薦保存液：0.01M PBS(pH7.4) 含1%BSA,0.03%
Proclin300和50%甘油，可-20℃保存一年。
05
染料-蛋白質(zhì)比率的計(jì)算
1
用PBS稀釋少量標(biāo)記蛋白。
2
使用路徑長(zhǎng)度為1cm的比色皿，在280nm處測(cè)量吸光度和特定染料的Amax（見附表）
3
計(jì)算蛋白質(zhì)濃度
C(mg/mL)={[A280-(Amax× Cf)]/1.4}×稀釋因子。
√C是染料-蛋白共軛物濃度；
√A280和Amax分別是在280nm處的吸光值以及在Amax波長(zhǎng)處的吸光值；
√Cf是染料校正因子見附表；
√稀釋因子是在光度測(cè)量時(shí)的稀釋倍數(shù)
4
計(jì)算標(biāo)記率的方法如下
DOL=(Amax×Mwt×稀釋因子）/(ε×C)
√C是染料-蛋白共軛物濃度；
√Mwt是IgG的分子量；
√ε是染料的摩爾吸光系數(shù)見附表。
注意事項(xiàng)
1. NHS酯類染料對(duì)水分敏感，SAlexa Fluor需現(xiàn)用現(xiàn)配；
2. 低濃度的疊氮鈉（0.02%）和10%甘油不會(huì)明顯干擾蛋白質(zhì)的標(biāo)記。但含有氨基的溶液及大于10%甘油對(duì)抗體的標(biāo)記效率有較大影響。標(biāo)記前應(yīng)盡量去除干凈；
3. 試劑盒組份在運(yùn)輸過程中可能造成顛倒，會(huì)使液體或干粉試劑沾到管壁或瓶蓋上。使用前請(qǐng)離心處理，以使附著管壁或瓶蓋的液體或干粉試劑沉積到管底；
4. DMSO屬微毒類，對(duì)人體皮膚有滲透性，眼有刺激作用，使用時(shí)避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。
附表
*：以nm為單位的激發(fā)波長(zhǎng)
ε：Amax時(shí)的摩爾消光系數(shù)(M-1 cm-1)
Cf：校正系數(shù)(A280/Amax)
相關(guān)產(chǎn)品
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