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藍白斑篩選及其原理介紹

藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法: 是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子,如α-互補、抗生素基因等?,F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點(MCS),它并不破壞讀框,但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能,這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此,宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性,但它們同時存在時,可形成具有酶學活性的蛋白質(zhì)。這樣,lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實現(xiàn)了互補,稱為α-互補。由α-互補而產(chǎn)生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍色菌落,因而易于識別。然而,當外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后,幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段,使得帶有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選,又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后,有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。

由α-互補產(chǎn)生的Lac+ 細菌較易識別,它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到載體的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變, 表達蛋白失活, 產(chǎn)生的氨基酸片段失去α-互補能力, 因此在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。 在麥康凱培養(yǎng)基上,α-互補產(chǎn)生的Lac+細菌由于含β-半乳糖苷酶,能分解麥康凱培養(yǎng)基中的乳糖,產(chǎn)生乳酸,使pH下降,因而產(chǎn)生紅色菌落,而當外源片段插入后,失去α-互補能力,因而不產(chǎn)生β-半乳糖苷酶,無法分解培養(yǎng)基中的乳糖,菌落呈白色。

藍白斑篩選的分子生物學基礎(chǔ)是建立在乳糖操縱子正負調(diào)控機制上的:

 1、乳糖操縱子的組成:大腸桿菌乳糖操縱子含Z、Y、A三個結(jié)構(gòu)基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶,此外還有一個操縱序列O,一個啟動子P和一個調(diào)節(jié)基因I。2、阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié):沒有乳糖存在時,基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列O處,乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài),不能合成分解乳糖的三種酶;有乳糖存在時,乳糖作為誘導物誘導阻遏蛋白變構(gòu),不能結(jié)合于操縱序列,乳糖操縱子被誘導開放合成分解乳糖的三種酶。所以,乳糖操縱子的這種調(diào)控機制為可誘導的負調(diào)控。3、CAP的正性調(diào)節(jié):在啟動子上游有CAP結(jié)合位點,當大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時,cAMP濃度升高,與CAP結(jié)合,使CAP發(fā)生變構(gòu),CAP結(jié)合于乳糖操縱子啟動序列附近的CAP結(jié)合位點,激活RNA聚合酶活性,促進結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后促進結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄,對乳糖操縱子實行正調(diào)控,加速合成分解乳糖的三種酶。4、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié):乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負調(diào)控與CAP的正調(diào)控兩種機制,互相協(xié)調(diào)、互相制約。
 
可以采用X-Gal而不是X-a-Gal進行Matchmaker System藍白斑篩選嗎?

不可以,X-Gal與X-a-Gal不同。X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶(lacZ)的反應底物,而X-a-Gal是酵母α-半乳糖苷酶(Mel 1p)的反應底物。X-a-Gal在Matchmaker Gold系統(tǒng)中用作藍白篩選的篩選標記,在蛋白互作激活MEL1基因表達后,酵母細胞可以分泌表達Mel 1p。

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