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活性氧檢測(cè)試劑盒的操作步驟
  活性氧檢測(cè)試劑盒操作步驟:
  一、裝載探針:
  對(duì)于刺激時(shí)間較短(通常為2 小時(shí)以內(nèi))的細(xì)胞,先裝載探針,后用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞刺激時(shí)間較長(zhǎng)(通常為6 小時(shí)以上)的細(xì)胞,先用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞,后裝載探針。
  原位裝載探針:本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1 ∶1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10μ mol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液,加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜,通常對(duì)于六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1mL 。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 分鐘。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。通常活性氧陽(yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20~30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
  收集細(xì)胞后裝載探針:按照1 ∶1000 用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10μmol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中,細(xì)胞濃度為一百萬(wàn)二千萬(wàn)/mL ,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3 ~5 分鐘顛倒混勻一下,使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞,或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通?;钚匝蹶?yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20~30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
  說(shuō)明:僅在陽(yáng)性對(duì)照孔中加入Rosup作為陽(yáng)性對(duì)照,其余孔不必加入Rosup。
  二、檢測(cè):
  對(duì)于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察,或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。對(duì)于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè),也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。
  三、參數(shù)設(shè)置
  使用488nm 激發(fā)波長(zhǎng),525nm 發(fā)射波長(zhǎng),實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF 的熒光光譜和FITC非常相似,可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)DCF 。

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